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徒手切割法體細(xì)胞克隆研究進(jìn)展

日期：2025-05-08 07:46
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摘要：


1997年2月，英國(guó)<Nature》雜志報(bào)道了英國(guó)羅斯林研究所的Wilmut等利用綿羊乳腺細(xì)胞進(jìn)行核移植試驗(yàn)，成功地獲得了世界上**只體細(xì)胞克隆綿羊——多利(Dolly)。這一成果有力地證明了成年哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞仍具有發(fā)育上的全能性，從而開創(chuàng)了哺乳動(dòng)物細(xì)胞核移植的新里程碑，在生物科學(xué)史上具有十分重要的意義。到目前為止，體細(xì)胞克隆技術(shù)已相繼在多種動(dòng)物上獲得成功，并顯示出巨大的應(yīng)用潛力和社會(huì)效益。

目前影響動(dòng)物體細(xì)胞核移植廣泛應(yīng)用的主要技術(shù)因素有：
(1)核移植效率低；
(2)實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備費(fèi)用高。技術(shù)難度大；
(3)妊娠率和產(chǎn)仔率低，出生后死亡及異常發(fā)育率高。

在克隆過(guò)程中成熟卵母細(xì)胞去核是核移植技術(shù)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。要求去得干凈，又盡可能地減少對(duì)細(xì)胞質(zhì)的損傷。如果去核不完全，可導(dǎo)致重組胚染色體的非整倍性，造成多倍體，卵裂異常，發(fā)育受阻和胚胎早期死亡。而如果要保證去核勢(shì)必要損失細(xì)胞質(zhì)，否則要使用熒光染色技術(shù)。目前使用的主要是顯微操作去核，需要價(jià)格昂貴的顯微操作儀和熟練的技術(shù)操作人員。此外，還需要相關(guān)的輔助工具制作設(shè)備如研磨機(jī)、微鍛爐等，而對(duì)其使用也需一定的技術(shù)水平。這些要求相當(dāng)程度地限制了核移植技術(shù)的簡(jiǎn)化及廣泛應(yīng)用。研究不需要顯微操作設(shè)備的核移植技術(shù)將會(huì)對(duì)體細(xì)胞核移植技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用起到巨大推動(dòng)作用。

1 HMC技術(shù)

徒手切割法體細(xì)胞克隆(Handmade Somatic Cell Cloning，HMC)是一項(xiàng)不需要顯微操作的核移
植方法，*早是Peura等 進(jìn)行牛胚胎細(xì)胞克隆時(shí)建立的，Vajta等【3 進(jìn)一步發(fā)展了此方法，成功應(yīng)用
于牛的體細(xì)胞核移植，并且得到后代 。HMC技術(shù)路線主要包括卵母細(xì)胞的去透明帶，徒手切割半卵
法去核，雙半卵融合、激活，以及支持無(wú)透明帶卵／胚胎培養(yǎng)技術(shù)。

1．1 卵母細(xì)胞去透明帶

1．2 卵母細(xì)胞的去核

1．3 卵母細(xì)胞的融合

目前常用的是電融合，根據(jù)電融合的次數(shù)可以分為一步法和兩步法。融合的電壓與動(dòng)物的種類有關(guān)。BLS細(xì)胞融合儀是一款專門為哺乳動(dòng)物設(shè)計(jì)的細(xì)胞融合儀，產(chǎn)品小,易操作,性價(jià)比極高.HMC技術(shù)結(jié)合BLS細(xì)胞融合儀CF-150B的使用,已成為此領(lǐng)域研究人員的理想選擇.

1．3．1 一步法

在電融合槽中一次同時(shí)將2枚去核后的半卵和1枚供核體細(xì)胞粘合在一起進(jìn)行融合，從而提高電擊融合效率。

具體做法是：
將半卵細(xì)胞與供體細(xì)胞先放入含有植物凝集素(PHA)的TCM～HEPES液滴中，通過(guò)圓頭粘合細(xì)玻璃針撥動(dòng)使一枚半卵先與一枚供體細(xì)胞粘合，然后再與另一枚半卵粘在一起，其排列順序?yàn)椋后w細(xì)胞一半卵～半卵，然后進(jìn)行電融合。在融合槽中施加交流電場(chǎng)，可使已經(jīng)粘成一串的3個(gè)細(xì)胞自動(dòng)排序，再給與直流電脈沖，可以一次性同時(shí)融合處理14個(gè)3細(xì)胞串，從而大大提高融合效率。電擊后3Orain內(nèi)觀察融合情況，沒(méi)有融合的再進(jìn)行電擊一次。

在牛的電融合實(shí)驗(yàn)中，其融合率達(dá)到(95．68±3．97) ]。利用一步融合法已經(jīng)生下5頭體細(xì)胞克隆牛
犢。也可以采用先將一枚半卵與一枚供體細(xì)胞用PHA法粘合，然后放入融合槽時(shí)再加入一枚半卵。
通過(guò)手工撥動(dòng)使粘有體細(xì)胞的半卵與另一枚半卵排序，然后通過(guò)提供一定電壓的交流電場(chǎng)使3個(gè)細(xì)胞
緊密聯(lián)結(jié)在一起，再應(yīng)用直流電脈沖一次性使3個(gè)細(xì)胞融合，一次可以融合處理4對(duì)細(xì)胞。

1．3．2 兩步法

相對(duì)一步法而言，主要是進(jìn)行兩次電融合。

具體過(guò)程：
半卯與供體細(xì)胞經(jīng)過(guò)有植物凝集素(PHA)的TCMHEPES液滴的處理后，一枚半卵先與供體細(xì)胞融合，融合后的半卵再與另一枚半卵進(jìn)行融合，但是**次融合的電壓要比**次的低。根據(jù)Vajta等的報(bào)道，經(jīng)過(guò)兩次融合，融合率可以達(dá)到76。運(yùn)用此法進(jìn)行核移植也得到克隆牛犢-4。j。

1．4 卵母細(xì)胞的激活

激活處理主要是化學(xué)激活，與常規(guī)相同。但也有化學(xué)激活與電激活相結(jié)合的。采用化學(xué)激活時(shí)去
透明帶的卵母細(xì)胞在二甲氨基嘌呤(DMAP)中采用微穴培養(yǎng)系統(tǒng)(WOW)培養(yǎng)法，一般每孔3O～100
個(gè)，具體依據(jù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)目而定。Kragh等 用HMC技術(shù)進(jìn)行豬的體細(xì)胞核移植時(shí)使用化學(xué)激活和
電激活相結(jié)合的方法，激活率為(49±1) 。

1．5 重構(gòu)胚的培養(yǎng)

與傳統(tǒng)核移植重構(gòu)胚的培養(yǎng)方法不同，HMC的胚胎由于去除了透明帶，其培養(yǎng)系統(tǒng)必須要能夠防
止重構(gòu)胚的相互粘連，因而采用隔離法群體培養(yǎng)。

1．5．1 微穴培養(yǎng)系統(tǒng)(well of the well，WOW) 

WOW *先報(bào)道于Vajta等 ，其簡(jiǎn)要過(guò)程如下：在四孔培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)液并覆蓋石蠟油預(yù)熱，然后用胚胎聚集針通過(guò)手腕用力并旋轉(zhuǎn)，在培養(yǎng)皿的底部均勻分布地壓下30～70個(gè)(視每組實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的卵母細(xì)胞數(shù)而定)圓錐形小凹。小凹的底部直徑約為120n，上口直徑約300 f』m，深度約為350 n 。

1．5．2 明膠一孔系統(tǒng) 

用胚胎培養(yǎng)液無(wú)牛血清白蛋白(BSA)和氨基酸]溶解明膠，濃度為19／6。在四孔板的孔中鋪上一層明膠，然后加入胚胎培養(yǎng)液并在上面覆蓋石蠟油。用直徑為5O～100rn的塑料小管在明膠上作孔，每孔放一個(gè)胚胎進(jìn)行培養(yǎng)。

1．5．3 微管法培養(yǎng)(GO 系統(tǒng)) 

GO系統(tǒng)(the glassoviductsystem)就是將重構(gòu)胚放人一端封Vi的毛細(xì)玻璃管中，玻璃管徑的大小要適宜，將培養(yǎng)液加入到玻璃管中然后進(jìn)行培養(yǎng)。Thouas等在研究小鼠的合子體外發(fā)育時(shí)，發(fā)現(xiàn)GO系統(tǒng)培養(yǎng)的囊胚其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、滋養(yǎng)外胚層以及早期桑椹胚的細(xì)胞數(shù)目明顯高于微滴法培養(yǎng)囊胚的細(xì)胞數(shù)，但操作不如微滴法簡(jiǎn)便。

1．6 核移植胚胎的冷凍

2  HMC技術(shù)的應(yīng)用前景

與常規(guī)核移植方法相比，HMC技術(shù)*大的特點(diǎn)是對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求相對(duì)而言不是太高，不需要顯
微操作儀，而且對(duì)技術(shù)人員的要求也降低許多。常規(guī)去核方法主要依靠**極體定位，因此需要必須是有**極體排出的成熟卵母細(xì)胞；而HMC技術(shù)則不需要那么嚴(yán)格，只要成熟的卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)均勻即可，從而可以提高卵母細(xì)胞的利用率。但HMC技術(shù)需要兩個(gè)卵母細(xì)胞才能得到一個(gè)重組胚，因而從整體上限制了核移植的成功率，但是核移植的效率卻可以大大提高。此外由于在融合時(shí)兩個(gè)半卵胞質(zhì)體來(lái)自不同的卵母細(xì)胞再加上供體細(xì)胞，重構(gòu)胚的DNA有可能來(lái)源于三方面，對(duì)胚胎的進(jìn)一步發(fā)育可能會(huì)產(chǎn)生影響。

目前通過(guò)此方法得到克隆動(dòng)物還不多，只有牛的成功報(bào)道，但是在其他動(dòng)物如豬 、綿羊現(xiàn)在也展開了研究，并且取得了一定進(jìn)展。Vanessa等用HMC技術(shù)進(jìn)行牛的體細(xì)胞連續(xù)核移植(SHMC)，成功得到一頭小牛。同時(shí)HMC技術(shù)有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)如進(jìn)行胚胎嵌合的研究]。總之，HMC技術(shù)由于其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，將會(huì)促進(jìn)核移植技術(shù)的發(fā)展。隨著該方法進(jìn)一步的提高和完善，HMC技術(shù)在哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞克隆胚胎產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中將發(fā)揮重要作用。
BLS細(xì)胞融合儀與HMC技術(shù)相結(jié)合,以成為該領(lǐng)域研究人員的理想選擇

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